***是否影響發(fā)育期**神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育一直是懸而未決而又具有重要意義的課題。傳統(tǒng)觀點推斷各種***在體內(nèi)的短暫作用不會引起神經(jīng)元及其連接的病理改變，但缺乏實驗觀察依據(jù)。相反，近年許多研究發(fā)現(xiàn)在腦發(fā)育的關(guān)鍵階段，動物神經(jīng)元活性的短暫改變（過度激活或抑制）即可造成神經(jīng)元形態(tài)和功能的異常，影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建^{[1]N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑可引起不同腦區(qū)廣泛的凋亡性神經(jīng)元退行性變。***是NMDA受體非竟爭性拮抗劑，臨床常用于小兒麻醉。麻醉、手術(shù)對學(xué)習(xí)記憶的影響已有研究}[2^，3]，但在發(fā)育早期***麻醉是否對空間辨別性學(xué)習(xí)記憶有遠期影響還鮮見報到。本研究采用神經(jīng)功能學(xué)和**組織化學(xué)的方法擬觀察新生大鼠***麻醉后空間辨別學(xué)習(xí)能力和海馬突觸素的變化，為***的合理應(yīng)用提供實驗依據(jù)。。腦爆發(fā)生長期應(yīng)用改變神經(jīng)元生理活性的

1.1動物及麻醉處理 新生1周Wister大鼠30只，體重18～20g，由西安第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。隨機均分為三組，每組10只。生理鹽水組（N組）：給予與***同體積生理鹽水；K100組和K50組麻醉誘導(dǎo)時分別腹腔注射***100mg/kg和50mg/kg，以后每小時追加首劑量的1/2，維持麻醉6h。大鼠平臥在自制的麻醉箱中實施麻醉，同時用嬰兒脈搏血氧飽和度探頭貼于小鼠腹部，監(jiān)測Sp0₂和HR，以防止麻醉過深所致大鼠腦缺氧，采集尾部血，用i-STAT型血氣分析儀（雅培公司，美國）行血氣分析均正常（距幼鼠尾3mm處剪斷鼠尾采血）。幼鼠麻醉結(jié)束后與母鼠同窩飼養(yǎng)。

1.21曠場實驗 曠場行為觀察箱為60cm×60cm×60cm的無頂木箱,箱底用墨線分為36個等份小方格。麻醉后3周大鼠自中央格放入，觀察在中央格停留時間和2min內(nèi)穿越的格子數(shù)。

1.22Morris水迷宮實驗 morris水迷宮為一直徑1.2ｍ、高0.5ｍ圓桶，劃為四個象限，盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水溫控制于22～25℃。將一直徑10cm平臺固定于某一象限，平臺在水平面下1cm。麻醉后16d開始水迷宮試驗。程序包括①定位航行試驗歷時5d，每天上下午各4次，將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中，記錄2min內(nèi)尋找平臺的時間(逃避潛伏期)；②空間探索試驗，將鼠任選一入水點放入水中，測其2min內(nèi)在原平臺處停留時間。整個認知功能測試過程中，保持實驗室內(nèi)燈光、物品擺放等室內(nèi)環(huán)境一致，以排除環(huán)境干擾。

1.31動物取材 認知功能測試完畢后立即將大鼠開胸，經(jīng)左心室至升主動脈插管，先以100ml生理鹽水沖洗血液，隨后用冷的（4℃）含40g/L多聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）先快后慢灌流固定2h，取腦置于300g/L蔗糖中（4℃）直至組織沉底，冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，切片分套，置于0.01MPBS中存放。

1.32**染色 取1套切片在0.01M PBS中漂洗后，入含0.3%Triton X-100的0.01MPBS中浸泡30min（室溫）。然后進行**組織化學(xué)熒光染色：加入突觸素I抗（1：500，Santa Cruz公司 美國）孵育24h（室溫，在濕盒內(nèi)）。在0.01MPBS液中漂洗3次，每次5min。加入熒光II抗（1：200，Chemicon公司 美國）閉光孵育2h.室溫避光孵育2h。0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，Confocal共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖象, 用Image J 圖象處理軟件（NIMH公司，美國）進行分析，以熒光半定量OD值來表示突觸素的表達水平。 

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行多組均數(shù)比較的方差分析及均數(shù)間的兩兩比較,用t檢驗，P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)    果

2.1***麻醉對新生大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 各組大鼠在曠場中央格的停留時間及穿越的方格數(shù)無顯著差異（P>0.05）。 水迷宮測試K₁₀₀和K₅₀組的逃逸潛伏期均明顯高于N組（P<0.05），尋找到平臺的時間較長，經(jīng)訓(xùn)練提高較慢。探索時間K₁₀₀和K₅₀組短于N組（P<0.05），大鼠常在四個象限無目的漫游。K₁₀₀組和K₅₀組之間差異無顯著意義（表1）。

2.2***麻醉對新生大鼠海馬SYN表達的影響 本實驗顯示: 正常狀態(tài)下,SYN在海馬CA_1、、CA₂和CA₃區(qū)呈現(xiàn)綠色熒光，N組的綠色熒光強度較弱，K₁₀₀組和K₅₀組的熒光強度較N組強，它們的OD值見（表1）。  

3討    論

突觸素是一種相對分子量為38×10³ 的鈣結(jié)合糖蛋白,特異性位于軸突終末端的突觸前囊泡膜上,是一種重要的囊泡膜標志蛋白^[4]。突觸素參與乙酰膽堿、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程, 與突觸可塑性關(guān)系密切。突觸可塑性是突觸對內(nèi)外環(huán)境變化作出反應(yīng)的能力，是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)^[5]。研究認為，突觸素一方面通過對突觸結(jié)構(gòu)的影響，另一方面通過其磷酸化作用調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而在突觸可塑性中起一定作用。突觸素影響突觸可塑性的觀點，已為大多數(shù)學(xué)者所接受，但是Spillance 等^[6]采用突觸素基因敲除的小鼠卻發(fā)現(xiàn)，突觸素對于海馬兩種不同形式的長時程增強(Long-time potention,LTP)的誘導(dǎo)或表達和由蛋白激酶激活而引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增加都不是必需的，認為突觸素并不是長時程增強的必需成分，morris水迷宮而LTP介導(dǎo)了突觸可塑性的發(fā)生，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，Rosahl等^[7]研究也認為突觸素并不是神經(jīng)突起長出、突觸發(fā)生和突觸囊泡交換所必需的。多種影響學(xué)習(xí)記憶功能的因素可能與突觸素及其磷酸化水平的改變密切相關(guān)。但突觸素作用的機制仍存在一些爭議，有待進一步深入研究。

  Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型。逃逸潛伏期表明獲取空間信息的能力，而探索時間表明記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。本研究結(jié)果表明,***麻醉新生1周大鼠（麻醉大鼠所需***的濃度為50mg/kg～100mg/kg），在麻醉后3周觀察到麻醉大鼠水迷宮逃逸潛伏期延長，探索時間縮短，提示麻醉大鼠與未麻醉大鼠的空間辨別學(xué)習(xí)和記憶能力出現(xiàn)下降。**組織化學(xué)表明***可上調(diào)海馬突觸素表達，.而Calhoun等^[8]研究卻發(fā)現(xiàn)，老年大鼠海馬齒狀回區(qū)突觸顆粒數(shù)量與大鼠在水迷宮的作業(yè)成績有顯著相關(guān)性。用人參皂甙對大鼠行腹腔注射，可使其海馬突觸素表達增強，在Morris水迷宮中的空間學(xué)習(xí)能力提高^9]。這些研究均提示學(xué)習(xí)記憶與突觸素的含量呈正相關(guān)性，而在本試研條件下卻發(fā)現(xiàn)，突觸素表達上調(diào)，而大鼠認知功能卻降低，與以往的研究結(jié)果相矛盾，因此，本研究認為，***導(dǎo)致大鼠認知功能下降的主要因素:（1）神經(jīng)元大量凋亡,既往研究表明，在哺乳類神經(jīng)突觸發(fā)生的關(guān)鍵期（大鼠生后2周內(nèi)），注射NMDA受體拮抗劑AP₅和MK-801可導(dǎo)致神經(jīng)細胞出現(xiàn)異常軸突側(cè)枝以及廣泛的神經(jīng)變性、凋亡^10]。猴如果在出生后2周內(nèi)阻斷NMDA受體，可出現(xiàn)大量凋亡性神經(jīng)降解^[11]。（2）NMDA受體表達增強。NMDA受體是離子型谷氨酸受體的一種。原位雜交證實NMDA受體阻斷劑MK-801和***增加新生大鼠NR1/NR_2A、抑制NR1/NR_2B的重組表達，引起受體結(jié)構(gòu)的變化。同時，本試研室研究還發(fā)現(xiàn)，***可上調(diào)海馬NMDAR₂及谷氨酸轉(zhuǎn)運體(GLAST)表達^[12]，而NMDA受體的上調(diào)表達能導(dǎo)致神經(jīng)興奮性毒性增加，從而影響其學(xué)習(xí)記憶功能。由于突觸素通過其磷酸化作用調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，相反NMDAR₂表達上調(diào)是否可引起突觸素表達上調(diào)，這種猜測將是我們下一步研究方向。

綜上所述，***可降低新生大鼠認知功能，并上調(diào)海馬突觸素的表達。
更多實驗方法請參考博客：blog.sina.com.cn/softmaze和公司網(wǎng)站：bjhstn.com。