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小動物活體成像技術概覽

小動物活體成像技術概覽
 1. 背景和原理:
1999年,美國哈佛大學Weissleder等人提出了分子影像學(molecular imaging)的概念——應用影像學方法,對活體狀態(tài)下的生物過程進行細胞和分子水平的定性和定量研究。

傳統(tǒng)成像大多依賴于肉眼可見的身體、生理和代謝過程在**狀態(tài)下的變化,而不是了解**的特異性分子事件。分子成像則是利用特異性分子探針追蹤靶目標并成像。這種從非特異性成像到特異性成像的變化,為**生物學、**早期檢測、定性、評估和**帶來了重大的影響。

分子成像技術使活體動物體內成像成為可能,它的出現(xiàn),歸功于分子生物學和細胞生物學的發(fā)展、轉基因動物模型的使用、新的成像**的運用、高特異性的探針、小動物成像設備的發(fā)展等諸多因素。目前,分子成像技術可用于——研究觀測特異性細胞、基因和分子的表達或互作過程,同時檢測多種分子事件,追蹤靶細胞,**和基因***優(yōu)化,從分子和細胞水平對**療效進行成像,從分子病理水平評估**發(fā)展過程,對同一個動物或病人進行時間、環(huán)境、發(fā)展和**影響跟蹤。

分子成像的優(yōu)點:
分子成像和傳統(tǒng)的體外成像或細胞培養(yǎng)相比有著顯著優(yōu)點。首先,分子成像能夠反映細胞或基因表達的空間和時間分布,從而了解活體動物體內的相關生物學過程、特異性基因功能和相互作用。**,由于可以對同一個研究個體進行長時間反復跟蹤成像,既可以提高數據的可比性,避免個體差異對試驗結果的可影響,又不需要殺死模式動物,節(jié)省了大筆科研費用。第三,尤其在**開發(fā)方面,分子成像更是具有劃時代的意義。根據目前的統(tǒng)計結果,由于進入臨床研究的**中大部分因為**問題而終止,導致了在臨床研究中大量的資金浪費,而分子成像技術的問世,為解決這一難題提供了廣闊的空間,將使**在臨床前研究中通過利用分子成像的方法,獲得更詳細的分子或基因述水平的數據,這是用傳統(tǒng)的方法無法了解的領域,所以分子成像將對新藥研究的模式帶來**性變革。其次,在轉基因動物、動物基因打靶或制藥研究過程中,分子成像能對動物的性狀進行跟蹤檢測,對表型進行直接觀測和(定量)分析;

2. 分類
分子成像技術主要分為光學成像、核素成像、磁共振成像和超聲成像、CT成像五大類。

2-1 光學成像
活體動物體內光學成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或DNA,而熒光技術則采用熒光報告基團(GFP、RFP, Cyt及dyes等)進行標記。利用一套非常靈敏的光學檢測儀器,讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng),可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性**發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數據, 得到多個時間點的實驗結果。相比之下,可見光體內成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄,跟蹤同一觀察目標(標記細胞及基因)的移動及變化,所得的數據更加真實可信。另外, 這一技術對腫瘤微小轉移灶的檢測靈敏度極高,不涉及放射性物質和方法, 非常**。 因其操作極其簡單、所得結果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內,已廣泛應用于生命科學、醫(yī)學研究及**開發(fā)等方面。
乳動物生物發(fā)光,是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶,當外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物熒光素(luciferin),即可在幾分鐘內產**光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下,催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光,因此只有在活細胞內才會產**光現(xiàn)象,并且光的強度與標記細胞的數目線性相關。對于**,lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成,帶有這種操縱子的**會持續(xù)發(fā)光,不需要外源性底物。
小動物活體成像技術概覽
基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。標記細胞的方法基本上是通過分子生物學克隆技術, 將熒光素酶的基因插到預期觀察的細胞的染色體內,通過單克隆細胞技術的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株。目前, 常用的細胞株基本上都已標記好, 市場上已有銷售。 將標記好的細胞注入小鼠體內后, 觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素,為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內熒光素酶標記的細胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應只產生一個光子,這是肉眼無法觀察到的,應用一個高度靈敏的制冷CCD相機及特別設計的成像暗箱和成像軟件,可觀測并記錄到這些光子。

光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收,光子遇到細胞膜和細胞質時會發(fā)生折射現(xiàn)象,而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)*少可以看到皮下的500個細胞,當然,由于發(fā)光源在老鼠體內深度的不同可看到的*少細胞數是不同的。在相同的深度情況下, 檢測到的發(fā)光強度和細胞的數量具有非常好的線性關系??梢姽怏w內成像技術的基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強度,同時反映出細胞的數量。

熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài),而后產**射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報告基團,標記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。 同生物發(fā)光在動物體內的穿透性相似,紅光的穿透性在體內比藍綠光的穿透性要好得多,近紅外熒光為觀測生理指標的*佳選擇。
小動物活體成像技術概覽
雖然熒光信號遠遠強于生物發(fā)光,但非特異性熒光產生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術分離背景光,但是受到熒光特性的限制,很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應用生物發(fā)光的方法來研究活體動物體內成像。 但是,熒光成像有其方便,便宜,直觀,標記靶點多樣和易于被大多數研究人員接受的優(yōu)點,在一些植物分子生物學研究和觀察小分子體內代謝方面也得到應用。對于不同的研究,可根據兩者的特點以及實驗要求,選擇合適的方法。*近許多文獻報道的實驗中,利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記,用成熟的熒光成像技術進行體外檢測,進行分子生物學和細胞生物學研究;然后利用生物發(fā)光技術進行動物體內檢測, 進行活體動物體內研究。

2-2核素成像
核素成像技術用于發(fā)現(xiàn)易于為核素標記的既定靶目標底物的存在,或用于追蹤小量標記基因**和進行許多**抵抗或病毒載體的傳送。包括微PET、微SPECT。

其中,微PET(正電子發(fā)射斷層掃描儀Positron Emission Tomography)在目前的分子影像學研究中占據著極其重要的地位。*先開始的分子影像學研究就是用PET完成的,如今,用微PET進行的單純胞疹病毒胸苷激酶的分子影像學技術已應用于臨床試驗中。
微PET技術是將正電子同位素標記的化合物注入生物體內作為探針,當這些化合物參與生物體內的代謝過程時,PET按照同位素放射性分布的**量進行連續(xù)性掃描,根據動力學原理和圖像數據,對活體組織中的生理生化代謝過程作出定量分析,如血流量、能量代謝、蛋白質合成、脂肪酸代謝、神經遞質合成速度、受體密度及其與配體結合的選擇性和動力學等。PET 通常使用的探針是用11C,14N, 15O 及18F 等生物組織中含量*多元素的放射性核素標記的化合物,它們具有與體內分子類似(包括細胞代謝)的特點。
在藥理學研究中,則可以用正電子同位素直接標記**,觀察其在活體中的分布和代謝,或測量生理性刺激及病理學過程中**分布與代謝的變化,從而對**劑量、作用部位、可能發(fā)生的毒副作用等做出前瞻性判斷。還可以判斷其代謝反應的類型及產物,觀察**與其他**的相互作用、**與營養(yǎng)物質的相互作用、**與受體的作用、**與酶的相互作用等。

2-3磁共振成像
磁共振(MRI)分子影像學的優(yōu)勢在于它的高分辨率(已達到μm級),同時可獲得解剖及生理信息。這些正是核醫(yī)學、光學成像的弱點。但是MRI分子影像學也有其弱點,它的敏感性較低(微克分子水平),與核醫(yī)學成像技術的納克分子水平相比,低幾個數量級。傳統(tǒng)的MRI是以物理、生理特性作為成像對比的依據。分子水平的MRI成像是建立在上述傳統(tǒng)成像技術基礎上,以特殊分子作為成像依據,其根本宗旨是將非特異性物理成像轉為特異性分子成像,因而其評價**的指標更完善,更具特異性。MRI分子影像學成像,可在活體完整的微循環(huán)下研究病理機制,在基因**后表型改變前,評價基因**的早期效能,并可提供三維信息,較傳統(tǒng)的組織學檢查更立體、快速。概括起來,MRI在分子影像學的應用主要包括基因表達與基因**成像、分子水平定量評價腫瘤血管生成、顯微成像、活體細胞及分子水平評價功能性改變等方面。

2-4超聲成像
此外,超聲分子影像學是近幾年超聲醫(yī)學在分子影像學方面的研究熱點。它是利用超聲微泡造影劑介導來發(fā)現(xiàn)**早期在細胞和分子水平的變化,有利于人們更早、更準確地診斷**。通過此種方式也可以在患病早期進行基因**、****等,以期在根本上****。

2-5CT成像
CT成像是利用組織的密度不同造成對X射線透過率的不同而對人體成像的臨床檢測技術。近來,由于具有更高的分辨率與靈敏度的微CT的出現(xiàn),使這項傳統(tǒng)的技術也進入分子成像領域。主要是應用在腫瘤學,骨科方面的研究。

3. 成像元素
要使活體中特定的分子成像,熒光成像和核素成像、超聲成像除了要有上述高分辨率、敏感、快速的成像技術,還要滿足如下幾個基本條件:
(1)具有高親和力的分子探針。分子探針和經典的造影劑的原理類似,它的一端聯(lián)有能夠和生物體內特異靶點結合的分子結構(如肽類、酶的底物、配體等),另一端是報告分子(可以是報告基因,也可以是熒光染料,或者放射性標記物),分子探針產生的信號則由圖像采集系統(tǒng)收集、處理。
(2)分子探針能夠克服各種生理屏障,包括血管壁、細胞間隙、細胞膜、血腦屏障等,這是分子成像的一大難點。
(3)生物信號放大系統(tǒng)。由于分子探針在體內的濃度非常低,所以需要通過化學或生物的方法使信號放大。這可以通過提高靶點結構的濃度等方法實現(xiàn)。
小動物活體成像技術概覽
值得一提的是,熒光成像技術由于背景噪音大,特異性差等因素外,熒光探針本身也需要進一步改進與提高,需要改進探針的通透性,提高活性和特異性,降低毒性和副作用等。目前這些改進都有專門的公司和機構在研究中。

4.分子成像技術/設備性能比較
不同類型的分子成像技術/設備有其各自的特點和應用領域,研究人員必須詳細了解這一點,才能選擇購買正確的設備。

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