摘要 目的：觀察 Tg-SwDI/B 小鼠空間記憶能力與腦內(nèi) β 淀粉樣(Aβ)蛋白分布的情況。方法：12 月齡純合子 Tg-SwDI/B 小鼠和野生型 C57BL/6 各 20 只，雌雄比例為 1∶1；通過八臂迷宮檢測小鼠的空間記憶能力，硫磺素 -S 染色和 GFAP **熒光染色顯示 Aβ 及星形膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠腦內(nèi)的分布特點(diǎn)。結(jié)果：Tg-SwDI/B 小鼠空間記憶功能明顯受損，表現(xiàn)為長期記憶功能下降，腦內(nèi)有大量纖維化 Aβ 沉積在血管或其周圍，并且可見 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，兩者均在海馬和丘腦區(qū)域更為多見。同月齡野生型小鼠腦內(nèi)未見纖維化 Aβ 沉積，存在少量 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，但數(shù)量明顯少于Tg-SwDI/B 小鼠。結(jié)論：Tg-SwDI/B 小鼠的空間記憶功能受損，可能與海馬區(qū)域血管相關(guān)性纖維化Aβ 和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生相關(guān)。

關(guān)鍵詞 Tg-SwDI/B 小鼠；八臂迷宮；纖維化；星形膠質(zhì)細(xì)胞；空間記憶受損

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年癡呆常見的原因之一，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降；腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)的主要臨床表現(xiàn)為腦葉出血，部分患者也有癡呆表現(xiàn)。AD 和 CAA 的共同病理特點(diǎn)是腦血管中有 β 淀粉樣(amyloidβ，Aβ)蛋白沉積。腦血管中沉積的 Aβ 大部分呈纖維化，與認(rèn)知功能受損相關(guān)。Tg-Sw-

DI/B 轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)突變的人型 APP基因，可用于研究 AD 和 CAA 的發(fā)病機(jī) 制 和 治 療 方 法 。 本 課 題 組 即 對Tg-SwDI/B 小鼠的空間記憶功能和腦內(nèi) Aβ 分布情況進(jìn)行研究。八臂迷宮與小鼠空間記憶能力的研究探討

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 純合子 Tg-SwDI/B小鼠購自美國 Jackson 實(shí)驗(yàn)室，該小鼠表達(dá)瑞典型 (Swedish K670N/M671L)、荷蘭型 (Dutch E693Q) 及愛荷華州型(Iowa D694N)3 種突變的人型 APP 基因。12 月齡純合子 Tg-SwDI/B 小鼠與同月齡野生型 C57BL/6 小鼠各 20 只，

雌雄比例為 1∶1，用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與材料 硫磺素 -S 購于 Sigma 公司，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibril-lary acidic protein，GFAP)兔抗小鼠多克隆抗體購于 Santa Cruz 公司，collagen IV 兔抗小鼠多克隆抗體購于 Abcam 公司，花青素 3(Cyanine3，Cy3) 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購于 Proteintech

公司；熒光顯微鏡(LX51)購于 OLYMPUS 公司。

1.2 方法

1.2.1 八臂迷宮 動物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境 1 周后稱重，實(shí)驗(yàn)前禁食 24 h。每天訓(xùn)練結(jié)束后限制性給予正常食料(2~3 g)，以使體重保持在正常進(jìn)食小鼠的 80%~85%。自由攝食訓(xùn)練：在迷宮各臂及中央分撒食物顆粒 (直徑約 3~4 mm)，同時將 4 只小鼠置于迷宮中央，讓其自由攝食10 min，訓(xùn)練 2 d；在每個臂靠近末端放 1 顆食粒，讓單只小鼠自由攝食，吃完或 10 min 后將其取出，訓(xùn)練 2 d。測試訓(xùn)練：隨機(jī)選 4 個臂末端各放 1 顆食粒，將小鼠放在迷宮中央，30 s后臂門打開，讓其在迷宮中自由攝食，吃完或10 min 后將小鼠取出，連續(xù)訓(xùn)練 10 d。記錄以下指標(biāo)：①工作記憶錯誤(working memory er-rors)，即在同一次訓(xùn)練中動物再次進(jìn)入已經(jīng)吃過食粒的臂：代表短期記憶；②參考記憶錯誤(reference memory errors)，即動物進(jìn)入不曾放過食粒的臂：代表長期記憶。

1.2.2 組織學(xué)染色 常規(guī)漂片法制作腦組織冰凍切片，片厚 20μm。①硫磺素 -S 染色：貼片法，經(jīng)過 100%、95%、80%及 70%酒精梯度至水，1%硫磺素 -S 染色 15 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，封片。②**熒光染色：含 0.3%Triton的山羊血清封閉 30min，加入 collagenIV 一抗(1∶400 稀釋)或 GFAP 一抗(1∶100 稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS 洗，5min×2 次，加入二抗(1∶100 稀釋)室溫孵育 2h，PBS洗，5min×2 次，封片。

1.2.3 形態(tài)學(xué)計(jì)量分析 每只小鼠選取相同部位 GFAP 染色切片 10 張，每張切片對海馬、丘腦及皮質(zhì)隨機(jī)測量 4 個視野，取平均值。所有視野放大 400 倍，通過 Image Pro Plus6.0 圖像分析軟件計(jì)算 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(x±s)表示，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 八臂迷宮結(jié)果

Tg-SwDI/B 小鼠參考記憶錯誤次數(shù)明顯多于野生型小鼠，從訓(xùn)練第 5 天開始差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；工作記憶錯誤次數(shù) 2 種小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 小鼠腦組織冰凍切片染色結(jié)果

2.2.1 硫磺素 -S 及 collagen IV 染色結(jié)果八臂迷宮與小鼠空間記憶能力的研究探討

Tg-SwDI/B 小鼠腦內(nèi)纖維化 Aβ 主要沿血管分布或聚集在血管周圍，多見于海馬和丘腦?？梢?/font>Tg-SwDI/B 小鼠腦內(nèi)血管有淀粉樣病變，而且主要發(fā)生在海馬和丘腦等微血管豐富的區(qū)域。同月齡野生型小鼠腦內(nèi)未見 Aβ 沉積。

2.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞染色 Tg-SwDI/B 小鼠全腦均可見 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，高倍鏡下活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)較多分支突起，密集分布在海馬和丘腦區(qū)域，在海馬齒狀回處陽性細(xì)胞聚集成團(tuán)。Tg-SwDI/B 小鼠海馬齒狀回、海馬下托、丘腦及皮質(zhì)的 GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)分別為 (65.5±4.9)、(39.2±2.8)、(43.3±8.2)及(25.8±2.8)10的3次方個 /mm的3次方，均顯著高于野生型小鼠的(38±0.5)、(23.7±3.2)、(6.6±3.8)及(12.3±3.1)10的3次方個 /mm的3次方(均 P<0.001)；Tg-SwDI/B 小鼠海馬齒狀回區(qū)域 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞密度*大。

3 討論

Swedish K670N/M671L 突變基因，位于APP 基因編碼的 β 分泌酶酶切位點(diǎn)處，可增強(qiáng) β 分泌酶水解能力，導(dǎo)致 Aβ 產(chǎn)量增加。Tg-SwDI/B 小鼠保留 Swedish K670N/M671L突變基因，同時引入 Dutch/Iowa 2 個突變基因，產(chǎn)生 Dutch/Iowa 突變 APP，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生 Dutch/Iowa 突變 Aβ 肽。體外研究發(fā)現(xiàn)，Dutch/Iowa 突變的 Aβ 在 22 和 23 位點(diǎn)存在負(fù)電荷丟失，導(dǎo)致可溶性 Aβ 更容易聚集組裝成纖維化 Aβ。且 Dutch/Iowa 突變 Aβ 與LRP-1(腦內(nèi)** Aβ 的重要受體)的親和力較野生型 Aβ 低，導(dǎo)致 Aβ **減少，更易滯留在血管周圍，產(chǎn)生腦血管淀粉樣病理改變。

硫磺素 -S 以及血管標(biāo)記物 collagen IV 多克隆抗體組織染色結(jié)果發(fā)現(xiàn) Tg-SwDI/B 小鼠腦內(nèi)纖維化 Aβ 主要沉積在血管或其周圍，多見于微血管豐富的海馬和丘腦區(qū)域，提示

Tg-SwDI/B 小鼠腦內(nèi)血管有明顯的淀粉樣病變。GFAP **熒光染色顯示 Tg-SwDI/B 小鼠腦內(nèi)可見大量 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)較多樹枝狀突起，海馬齒狀回處 GFAP 陽性細(xì)胞密度*大。同月齡野生型小鼠腦內(nèi)未見 Aβ 沉積，可觀察到 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，但其在各個腦區(qū)細(xì)胞密度均少于 Tg-SwDI/B 轉(zhuǎn)基因小鼠。綜上所述，Tg-SwDI/B 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)域既有豐富的纖維化 Aβ 沿血管沉積，又有較多的 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，提示纖維化 Aβ 和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生有一定的相關(guān)性，此結(jié)果與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致。有文獻(xiàn)報(bào)道，3 月齡時Tg-SwDI/B 轉(zhuǎn)基因小鼠就能在海馬下托處出現(xiàn)沿血管沉積的纖維化 Aβ、少量活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，隨著月齡的增長 Aβ沉積增多，6 月齡時可在嗅球和丘腦區(qū)域出現(xiàn)Aβ 沉積和炎癥細(xì)胞浸潤，12 月齡時整個前腦都可見沉積和大量神經(jīng)炎癥細(xì)胞。Tg-SwDI/B小鼠較其他轉(zhuǎn)基因 AD 小鼠模型 (如單轉(zhuǎn)Tg2576、雙轉(zhuǎn) APPSwe/PS1 小鼠模型)能更早出現(xiàn)顯著的腦血管淀粉樣病變。

八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 Tg-SwDI/B 小鼠空間記憶能力受損，且表現(xiàn)為長期記憶功能下降。有研究通過巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 3 月齡的 Tg-SwDI/B 小鼠就表現(xiàn)出空間記憶功能障礙。海馬在空間學(xué)習(xí)與記憶中發(fā)揮著重要作用，本研究中發(fā)現(xiàn) Tg-SwDI/B 小鼠海馬區(qū)域有大量纖維化Aβ沿血管分布，并且存在大量活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，推測纖維化Aβ和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生可能影響海馬神經(jīng)元的功能，導(dǎo)致小鼠空間記憶能力受損。研究發(fā)現(xiàn)減輕Aβ負(fù)荷或****能改善AD小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力。

綜上所述，Tg-SwDI/B 轉(zhuǎn)基因小鼠在行為學(xué)上很早即出現(xiàn)明顯空間記憶受損，且有早發(fā)的腦血管淀粉樣病變和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，是研究 AD及 CAA等**的良好動物模型。