【摘 要】 目的: 探討慢性應(yīng)激性刺激引起的抑郁狀態(tài)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元再生的影響。方法: 建立大鼠慢性應(yīng)激性抑郁癥模型，通過(guò)開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和蔗糖飲水實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化; 取大鼠腦冰凍切片行 Doublecortin ( DCX)**熒光檢測(cè)海馬新生神經(jīng)元。結(jié)果: 慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分降低，蔗糖偏嗜度降低，且體重明顯減輕; **熒光結(jié)果顯示慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬齒狀回顆粒下層( subgranularzone SGZ) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞減少。結(jié)論: 慢性應(yīng)激性刺激引起的抑郁狀態(tài)下大鼠海馬神經(jīng)元再生能力減弱，提示海馬神經(jīng)元再生的損害可能參與了抑郁癥的病理過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】 慢性應(yīng)激性刺激; 抑郁癥; 模型; 海馬; 神經(jīng)元再生

抑郁癥是一種常見(jiàn)的情感性精神障礙，具有較高的復(fù)發(fā)率和終生患病率，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。慢性不可預(yù)知性應(yīng)激性刺激( chronic un-predictable stress，CUS) 是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外用于抑郁癥動(dòng)物模型制作方法之一，目前被廣泛運(yùn)用于抑郁癥的病理生理機(jī)制研究。研究表明慢性應(yīng)激性刺激能引起大腦器質(zhì)性損害，尤其是海馬結(jié)構(gòu)和功能的損害，因此可誘發(fā)抑郁癥狀的發(fā)生。另外，神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性和神經(jīng)細(xì)胞順應(yīng)性的損害也參與了抑郁癥的發(fā)病過(guò)程。海馬作為介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)，也是大腦可塑性極易受損的一個(gè)腦區(qū)，因而在研究抑郁癥病因和發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。

本文采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激的方法建立大鼠抑郁癥模型，利用開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和蔗糖飲水實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化，同時(shí)通過(guò)**熒光法觀察大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元再生，探討慢性應(yīng)激抑郁狀態(tài)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元再生的影響，從而為抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料和方法

1 材料

1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36 只成年 SD 雄性大鼠，SPF 級(jí)，購(gòu)入時(shí)體重 200 ～ 220 g，購(gòu)自南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)前在安靜的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，大鼠每籠 4 只群養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫 22 ～24℃，相對(duì)濕度( 50 ±10) %，自然晝夜節(jié)律性光照。

1． 2 大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型的建立 36 只大鼠被隨機(jī)分為兩組: ①正常對(duì)照組 16 只: 正常飲水進(jìn)食，不給任何刺激。②慢性應(yīng)激模型組 20 只: 給予慢性不可預(yù)知的刺激。由于機(jī)體對(duì)單一應(yīng)激原的刺激易產(chǎn)生耐受性，因此本實(shí)驗(yàn)采用多種不可預(yù)知的刺激

方式交替進(jìn)行，建立大鼠慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型。慢性應(yīng)激時(shí)程共計(jì) 5 周，應(yīng)激方式如下: ①食物剝奪( 禁食) ，12 h; ②禁水，12 h; ③夾尾( 距尾根1 cm 夾

閉) ，1 min; ④噪音刺激( 110 dB) ，1 h; ⑤傾斜飼養(yǎng)( 傾斜 45 度) ，12 h; ⑥ 通宵照明，12 h; 以上應(yīng)激方式每天隨機(jī)使用一種，但禁水、禁食隔開(kāi)進(jìn)行。

2 方法

2． 1 行為學(xué)檢測(cè) 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)( Open-field) 所用敞箱為高 40 cm、長(zhǎng)寬均為 80 cm 內(nèi)空的立柱體，周壁為黑色，底面用白線劃分為面積相等的 25 塊。以動(dòng)物穿越底面方塊數(shù)作為水平活動(dòng)( crossing) 得分，以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)( rearing) 得分。每只動(dòng)物僅進(jìn)行一次測(cè)定，每次 5 min。行為評(píng)定采用盲法，在安靜房間內(nèi)，由三名觀察者進(jìn)行，取三人的各指標(biāo)平均值作為實(shí)驗(yàn)大鼠原始的行為學(xué)數(shù)據(jù)。蔗糖飲水實(shí)驗(yàn)步驟如下: 應(yīng)激刺激結(jié)束后，讓各組動(dòng)物任意飲用兩瓶不同的水: 其中一瓶為含 1%蔗糖的自來(lái)水、一瓶為自來(lái)水。測(cè)試下午 4∶ 00 至**天上午 8∶ 00 自來(lái)水和蔗糖水的飲用量( 通過(guò)稱飲水瓶重量) ，以蔗糖偏嗜度( saccharose preference) 表示，蔗糖偏嗜度/% = 蔗糖水飲用量/( 蔗糖水飲用量+ 自來(lái)水飲用量) ，作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。比較不同組蔗糖偏嗜度的變化。

2． 2 **熒光雙標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠經(jīng)麻醉、開(kāi)胸，用生理鹽水 100 ml 及 4% 多聚甲醛的 0． 1 mol/LPBS( pH 7． 2) 400 ml 經(jīng)心灌注，取腦。后固定 4 h，蔗糖平衡沉底，冰凍切片機(jī)冠狀切片，片厚 30 μm，從海馬開(kāi)始處出現(xiàn)收集切片，切片漂于 0． 01 mol/LPBS( pH 7． 2) 中。切片用 0． 01 mol/L PBS( pH 7． 2) 漂洗，經(jīng) 10%山羊血清封閉過(guò)夜。每張切片滴加小鼠抗 DCX 的單克隆抗體( 1∶ 1000，Abcam 公司) 50 μl，4℃濕盒孵育 24 h。用 0． 01 mol/L PBS( pH 7． 2) 漂洗 3 遍后，

在避光條件下，每張切片滴加山羊抗小鼠**抗體( 1∶ 50，Chemicon 公司) ，4℃濕盒孵育 24 h。在避光條件下，PBS 洗片 3 遍后，每張切片滴加 Hoechst33342 染液 50 μl( 1∶ 1500，Sigma 公司) ，室溫下避光振搖30 min 后，PBS 漂洗3 遍，中性甘油封片。先后在激發(fā)光波長(zhǎng)為 495 nm、吸收光波長(zhǎng)為 520 nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為346 nm、吸收光波長(zhǎng)為460 nm 的熒光顯微鏡下觀察 DCX/Hoechst 陽(yáng)性細(xì)胞并攝片。

2． 3 圖像處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 拍攝的熒光照片通過(guò) Leica Qwin plus 軟件行 DCX、Hoechst 熒光雙標(biāo)圖片的合成。在低倍視野( ×10) 下計(jì)數(shù)海馬齒狀回內(nèi)DCX 陽(yáng)性細(xì)胞，在高倍視野( × 40) 下測(cè)量 DCX 陽(yáng)性細(xì)胞胞體周長(zhǎng)和突起長(zhǎng)度。以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋 ± s)表示其數(shù)量，并采用 spss11 統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析( one-way ANOVA) 。P ＜0． 05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠行為學(xué)檢測(cè)

1． 1 體重和開(kāi)場(chǎng)行為指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)之前，兩組動(dòng)物在體重、水平穿越格數(shù)( Crossing) 、直立次數(shù)( Ｒea-ring) 上相比無(wú)差異( P ＞ 0． 05) 。而在 28 天之后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組體重低于對(duì)照組( P ＜0． 01) ，實(shí)驗(yàn)組水平穿越格數(shù)減少( P ＜ 0． 01) ; 直立次數(shù)減少( P ＜0． 01，表 l，F(xiàn)ig． 1) 。

2 **熒光雙標(biāo)檢測(cè)

呈綠色熒光的 DCX 陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在大鼠海馬齒狀回顆粒下下層( SGZ) 區(qū)，胞漿和突起均顯綠色。模型組大鼠 SGZ 區(qū) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞分布稀疏，明顯少于對(duì)照組 SGZ 區(qū) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。但模型組 SGZ 區(qū)多數(shù) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞胞體較大，突起長(zhǎng)，而對(duì)照組 SGZ 區(qū) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞以胞體小，短突起細(xì)胞為主( Fig． 2) 。兩者比較結(jié)果為模型組 DCX 陽(yáng)性細(xì)胞平均胞體周長(zhǎng)( μm) 為 201． 36 ±16． 12 高于對(duì)照組 134． 81 ±15． 45，P ＜0． 01; 模型組 DCX 陽(yáng)性細(xì)胞突起平均長(zhǎng)度為 26． 74 ±6． 33 長(zhǎng)于對(duì)照組 14． 20± 5． 06，P ＜ 0． 01。慢性應(yīng)激抑郁狀態(tài)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元再生的影響

討 論

在本研究中建立大鼠抑郁模型主要采用輕度、不可預(yù)見(jiàn)的應(yīng)激性刺激長(zhǎng)期作用于大鼠，使其產(chǎn)生抑郁癥狀，這與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激原促進(jìn)**發(fā)生、加速**發(fā)展的機(jī)理相似。實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)過(guò) 35 d 的慢性應(yīng)激性刺激，與對(duì)照組相比開(kāi)場(chǎng)活動(dòng)減少，表明抑郁模型大鼠緊張程度增加、興趣喪失和認(rèn)知能力的減退。實(shí)驗(yàn)組大鼠對(duì)糖水適應(yīng)減少反映了模型大鼠的興趣和欲望的缺失，這也與臨床抑郁癥患者所表現(xiàn)的精神運(yùn)動(dòng)改變、興趣或快感的喪失等有很大程度的相似性。從大鼠體重的變化來(lái)看，經(jīng)過(guò)慢性應(yīng)激后大鼠體重較對(duì)照組明顯減輕，這也與臨床抑郁癥病人的體重變化相符合，表明本實(shí)驗(yàn)中大鼠抑郁癥模型的制作是成功的。

目前研究認(rèn)為抑郁癥發(fā)**展與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性損傷有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道慢性應(yīng)激可導(dǎo)致海馬出現(xiàn)多種可塑性損害的表現(xiàn): 海馬體積減小，CA3 區(qū)錐體細(xì)胞萎縮，數(shù)目減少，齒狀回顆粒細(xì)胞增生抑制，同時(shí)伴有學(xué)習(xí)、記憶和情緒反應(yīng)的缺陷。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬齒狀回SGZ 區(qū) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，而且均為胞體較大，且突起長(zhǎng)的成熟細(xì)胞，表明在 SGZ 區(qū)神經(jīng)元前體細(xì)胞減少，尤其是新生神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)目下降明顯，這可能是慢性應(yīng)激狀態(tài)下海馬齒狀回顆粒細(xì)胞增生抑制的可能機(jī)制。眾所周知海馬齒狀回顆粒下層是成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元再生的重要區(qū)域，位于SGZ 區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)向神經(jīng)元前體細(xì)胞方向分化，新生神經(jīng)元前體細(xì)胞不斷成熟并逐漸遷移到顆粒層接受或投射纖維到 CA3 區(qū)。因此，位于 SGZ區(qū)的神經(jīng)元前體細(xì)胞減少可能是抑郁模型大鼠 CA3區(qū)錐體細(xì)胞萎縮，數(shù)目減少的根本原因。有報(bào)道稱給予抗抑郁類**氟西汀、氟伏沙明和三環(huán)類去甲丙米嗪，使海馬 CA3 區(qū)和齒狀回的樹(shù)突棘濃度顯著增加，表現(xiàn)出對(duì)海馬神經(jīng)元的正性營(yíng)養(yǎng)作用。表明抗抑郁藥僅能改善癥狀而不能逆轉(zhuǎn)病程，因?yàn)槭艿綋p害的海馬神經(jīng)元沒(méi)有得到有效的補(bǔ)充。

一般來(lái)說(shuō)，SGZ 區(qū) DCX 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目下降的原因主要有三種可能: SGZ 區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖抑制; 神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元前體細(xì)胞分化抑制; 新生神經(jīng)元前體細(xì)胞存活率下降，或者多種因素綜合作用的結(jié)果。不同類型的刺激對(duì)于海馬新生神經(jīng)元的影響，以及其中的分子機(jī)制還有待于在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明，通過(guò)補(bǔ)充新生神經(jīng)元減少慢性應(yīng)激所致的海馬可塑性損害將為臨床**抑郁癥以及其它應(yīng)激相關(guān)性精神障礙提供新的**思路。