原始文獻(xiàn)：

Zhang, X., Kim, J., & Tonegawa, S. (2020). Amygdala Reward Neurons Form and Store Fear Extinction Memory.Neuron, 105(6).

原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627319310918www.sciencedirect.com

恐懼消退需要形成新的印跡（engram）細(xì)胞。
恐懼消退印跡細(xì)胞存在于基底外側(cè)杏仁核的Ppp1r1b+神經(jīng)元中。
恐懼消退印跡細(xì)胞和獎賞相關(guān)神經(jīng)元是高度重疊的，功能上相互轉(zhuǎn)換。
恐懼消退記憶是一種獎賞記憶——期望中有害刺激的缺失是一種獎賞。

恐懼行為是神經(jīng)科學(xué)研究中的一個重要課題。在模式動物上研究恐懼行為的一個常見方法就是利用恐懼條件反射，即同時給予動物無害刺激（條件刺激，CS）和有害刺激（非條件刺激，US），使動物對無害刺激形成條件反射。恐懼記憶形成后，長時間給予動物單純的條件刺激能夠使動物的恐懼條件反射減弱，這被稱作恐懼消退（fear extinction）。杏仁核（amygdala）被認(rèn)為是一個與恐懼密切相關(guān)的腦區(qū)。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala，BLA）中存在兩類神經(jīng)元，Ppp1r1b+神經(jīng)元和Rspo2+神經(jīng)元（根據(jù)特定的基因表達(dá)區(qū)分），它們分別對正價刺激和負(fù)價刺激起反應(yīng)，并且相互間存在拮抗作用。本文的作者就試圖研究Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退中的作用。

研究人員以小鼠為實驗對象采用了一個環(huán)境依賴的恐懼消退范式。實驗組小鼠在第Yi天在實驗籠中接受三個周期的電刺激，對環(huán)境產(chǎn)生恐懼記憶。第er天小鼠仍被放入實驗籠中，但不再有電刺激，以此進行恐懼消退的訓(xùn)練。第三天小鼠再一次被放入無電刺激的實驗籠中進行測試。另外有兩個對照組實驗：無恐懼消退訓(xùn)練的NonExt組和始終無電刺激的NonShock組。實驗組和NonExt組在第Yi天實驗中，恐懼表現(xiàn)（freezing）逐漸明顯；經(jīng)過第er天的消退訓(xùn)練后，實驗組的恐懼程度顯著低于NonExt組，而NonShock組的恐懼表現(xiàn)始終處于極低的水平。

研究人員隨即對實驗組和對照組的小鼠腦組織進行了單分子熒光原位雜交（smFISH）來檢測Fos、Rspo2、Ppp1r1b的表達(dá)情況。熒光結(jié)果顯示，Rspo2+神經(jīng)元的活性在仍具有恐懼記憶的NonExt組小鼠中顯著，而在實驗組和NonShock組小鼠中沒有顯著區(qū)別；Ppp1r1b+神經(jīng)元僅在發(fā)生了恐懼消退的實驗組小鼠中被激活。

接下來研究人員又利用顯微內(nèi)窺鏡進行在體鈣成像追蹤Rspo2+神經(jīng)元和Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退實驗期間的激活動態(tài)。Rspo2+神經(jīng)元在第Yi天受到電刺激時（恐懼習(xí)得）以及第er天剛進入實驗籠時（恐懼取回）活性上升，在恐懼消退過程中及第三天的測試中活性降低。Ppp1r1b+神經(jīng)元則剛好相反，在恐懼消退過程中及恐懼消退后具有高活性。研究者也發(fā)現(xiàn)，在恐懼習(xí)得中被激活的Rspo2+神經(jīng)元，大多會在恐懼取回時被再度激活；而在恐懼消退過程中被激活的Ppp1r1b+神經(jīng)元，也大多會在第三天的恐懼消退測試中被再度激活。鈣成像的結(jié)果與c-Fos一致，反映了Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退中被激活，而恐懼激活的Rspo2+神經(jīng)元在恐懼消退中活性受抑制。

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研究人員分別向Rspo2-Cre小鼠和Ppp1r1b-Cre小鼠中注射攜帶有ChR2或eArchT的Cre依賴AAV病毒，特異性標(biāo)記并操縱Rspo2+神經(jīng)元和Ppp1r1b+神經(jīng)元。光遺傳實驗顯示，在恐懼消退期間激活Rspo2+神經(jīng)元或抑制Ppp1r1b+神經(jīng)元能夠顯著降低恐懼消退的程度，而激活Ppp1r1b+神經(jīng)元或抑制Rspo2+神經(jīng)元可以促進恐懼消退（加速習(xí)得過程），但對恐懼消退的Z終結(jié)果沒有影響。在恐懼消退習(xí)得完成后（第三天測試時）抑制Ppp1r1b+神經(jīng)元可以逆轉(zhuǎn)消退學(xué)習(xí)的結(jié)果，但激活該神經(jīng)元則無顯著影響。光遺傳實驗的結(jié)果進一步表明了這兩類神經(jīng)元在恐懼消退中的拮抗作用，以及Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退的記憶中的重要作用。

研究人員接下來開始探究能否在pBLA的Ppp1r1b+神經(jīng)元中找到恐懼消退的印跡（engram）細(xì)胞。研究人員向Ppp1r1b-Cre小鼠的pBLA中注射了下圖所示的AAV病毒，使他們能夠在特定時間標(biāo)記上激活了的Ppp1r1b+神經(jīng)元并對其進行遺傳操作。已經(jīng)恐懼消退完成的小鼠在第三天的測試時激活的Ppp1r1b+神經(jīng)元被標(biāo)記并轉(zhuǎn)入ChR2。這些小鼠再一次經(jīng)歷了三天的恐懼消退實驗，而光激活上述被標(biāo)記的Ppp1r1b+神經(jīng)元能夠顯著提升恐懼消退的速度。對Rspo2+神經(jīng)元進行同樣的實驗則沒有任何顯著結(jié)果。利用同樣的方法，向被標(biāo)記的Ppp1r1b+神經(jīng)元中轉(zhuǎn)入ArchT，光抑制這些Ppp1r1b+神經(jīng)元可以顯著逆轉(zhuǎn)恐懼消退的結(jié)果，并且Rspo2+神經(jīng)元的活性顯著提高。這些結(jié)果表明，恐懼消退記憶的印跡細(xì)胞確實存在于Rspo2+神經(jīng)元中，這些印跡細(xì)胞對恐懼消退記憶的維持其中重要的作用，并且能夠抑制與恐懼有關(guān)的Rspo2+神經(jīng)元的活動。

摘自原文Fig4，只有被激活并且表達(dá)Ppp1r1b的神經(jīng)元會被轉(zhuǎn)入ChR2-EYFP／EYFP，并且該序列的表達(dá)可以通過給小鼠喂食doxycycline (Dox)進行抑制，因此研究人員可以標(biāo)記上特定時間的目標(biāo)神經(jīng)元。

之前的研究表明，pBLA中的Ppp1r1b+神經(jīng)元有一部分對飲食獎賞有反應(yīng)，研究人員接下來研究了這兩種Ppp1r1b+神經(jīng)元間的關(guān)系。小鼠被禁水Yi天后再給予飲水獎賞，研究人員用病毒注射標(biāo)記上了對獎賞起反應(yīng)的Ppp1r1b+神經(jīng)元。小鼠接下來被分為四組，分別進行禁水+給水，禁食+給食，恐懼消退，恐懼（無消退，即NonExt組）的實驗。研究人員隨即檢測了c-Fos表達(dá)情況，結(jié)果顯示，飲水獎勵、進食獎勵和恐懼消退的三組小鼠之間，被標(biāo)記的Ppp1r1b+神經(jīng)元中表達(dá)c-Fos的比例和表達(dá)c-Fos的神經(jīng)元中被標(biāo)記的比例都沒有顯著差異，但都顯著高于NonExt組。這一結(jié)果顯示對獎賞起反應(yīng)的Ppp1r1b+神經(jīng)元與恐懼消退相關(guān)的Ppp1r1b+神經(jīng)元有著很高的重疊度。動態(tài)的鈣成像實驗也進一步證明了這一結(jié)果。

研究人員還用神經(jīng)元被標(biāo)記/遺傳操作的小鼠進行了光遺傳自我刺激行為測試（optogenetic self-stimulation behavior test）和光遺傳實時空間偏好測試（optogenetic real-time place preference test）。無論是通過飲水獎勵還是恐懼消退標(biāo)記上Ppp1r1b+神經(jīng)元的小鼠，都有相當(dāng)一部分表現(xiàn)出了自我刺激行為或空間偏好（即有主動激活Ppp1r1b+神經(jīng)元的偏好）。而光激活通過飲水獎勵標(biāo)記/遺傳操作的Ppp1r1b+神經(jīng)元也能夠提高恐懼消退的速度。這些結(jié)果進一步表明了與恐懼消退相關(guān)的和與飲食獎賞相關(guān)的Ppp1r1b+神經(jīng)元是高度相關(guān)的，恐懼消退在神經(jīng)元水平上可以被認(rèn)為是一種獎賞。

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