2023年11月12日中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉欣剛研究團(tuán)隊(duì)在Science of the Total Environment雜志發(fā)表了“Imidacloprid affects the visual behavior of Mature zebrafish by mediating the expression of opsin and phototransduction genes and altering the metabolism of neurotransmitters”，揭示了吡蟲啉通過介導(dǎo)視蛋白和光轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)，改變神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，從而影響成年斑馬魚的視覺行為。

吡蟲啉是硝基亞甲基類內(nèi)吸殺蟲劑，是煙堿乙酰膽堿受體的作用體，干擾害蟲運(yùn)動神經(jīng)系統(tǒng)使化學(xué)信號傳遞失靈，吡蟲啉對水生生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成重大威脅。本研究探討了吡蟲啉對成年斑馬魚的視覺毒性及其分子機(jī)制。視動反應(yīng)是指斑馬魚對移動的目標(biāo)有一種追逐的行為，該反應(yīng)可以用來檢測幼魚和成魚的視覺相關(guān)基因突變。視動反應(yīng)(OKR)和視運(yùn)動反應(yīng)(OMR)測試是經(jīng)典的用于檢測斑馬魚視覺功能異常的行為測試（OKR/OMR設(shè)備和分析軟件購自上海欣軟）。利用該設(shè)備在環(huán)境相關(guān)濃度暴露吡蟲啉21天后，檢測發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚的視覺行為受損，Immunofluorescence Experiment表明，斑馬魚視網(wǎng)膜中視紫紅質(zhì)的含量發(fā)生了明顯的變化。在成年斑馬魚中，基因表達(dá)節(jié)律在暗和亮光捕獲中起關(guān)鍵作用，以及光轉(zhuǎn)導(dǎo)的24小時(shí)被顯著破壞。靶向代謝組學(xué)分析顯示，與神經(jīng)遞質(zhì)功能相關(guān)的16種代謝物的含量發(fā)生了顯著變化，并在精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、色氨酸代謝等前三種代謝途徑中富集。這些結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度的吡蟲啉暴露可通過干擾視蛋白的表達(dá)，影響斑馬魚成蟲視網(wǎng)膜中的光轉(zhuǎn)導(dǎo)而引起光毒性。

測試裝置為透明圓柱形魚缸，直徑為7 厘米，高7厘米，直徑8.5厘米的滾輪放置在魚缸周圍有光柵條（12個(gè)周期的黑白條紋）。外部光系統(tǒng)由兩個(gè)圓形光管組成，直徑為21厘米，調(diào)節(jié)亮度。實(shí)驗(yàn)視頻是在帶攝像頭的顯微鏡（OLYMPUS SZX10，日本），可捕獲并記錄實(shí)時(shí)運(yùn)動。所有OKR和OMR測試均已通常在10:00至16:00之間進(jìn)行。OKR/OMR設(shè)備和分析軟件對從眼球追蹤設(shè)備收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以確定順時(shí)針和逆時(shí)針方向的網(wǎng)格刺激對眼球運(yùn)動的影響。OMR測試中可檢測運(yùn)動距離（m）、運(yùn)動速度（m/s）、PPR時(shí)間（s）、PNR時(shí)間（s）和僵直時(shí)間（s）等。

與對照組相比，暴露于吡蟲啉濃度10 μg/L 21天，成年斑馬魚右眼受到順時(shí)針刺激時(shí)，慢相時(shí)間和反射增益均顯著減少，掃視運(yùn)動頻率增加當(dāng)改為逆時(shí)針刺激時(shí)，暴露于10 μg/L吡蟲啉的成年斑馬魚右眼和左眼的慢相位時(shí)間以及反射增益均顯著減少。與對照組相比，用10 μg/L濃度的吡蟲啉處理后各組左右眼的眼跳運(yùn)動頻率明顯增強(qiáng)。然而，濃度為1和100 μg/L的吡蟲啉的斑馬魚的參數(shù)沒有顯著變化。這些結(jié)果表明，濃度為10 μg/L的吡蟲啉暴露影響了斑馬魚對視覺刺激的平穩(wěn)跟蹤和準(zhǔn)確、有效的快速眼球運(yùn)動的能力，這可能會影響斑馬魚的運(yùn)動協(xié)調(diào)。

成年斑馬魚在接受順時(shí)針和逆時(shí)針網(wǎng)格刺激時(shí)，行走距離和速度顯著下降，10 μg/L和100 μg/L處理組斑馬魚的凍結(jié)時(shí)間顯著增加。此外，與對照組相比，10 μg/L吡蟲啉處理的成年斑馬魚在刺激方向的游泳時(shí)間顯著減少。這些結(jié)果表明，吡蟲啉暴露對成年斑馬魚的視覺系統(tǒng)處理和視覺引導(dǎo)下的自我運(yùn)動的能力有負(fù)面影響，證實(shí)了OKR試驗(yàn)的結(jié)果。

作者接下來進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以確定視網(wǎng)膜切片是否發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，視網(wǎng)膜層是否受到特異性影響。對照組和用藥組形態(tài)完整，形狀規(guī)則，由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)叢狀、內(nèi)核、外叢狀、外核層、光感受器和色素細(xì)胞組成。Immunofluorescence Experiment使用特異性抗體標(biāo)記視網(wǎng)膜中相應(yīng)的標(biāo)記物。結(jié)果顯示，Sox2（Sry-box 2，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記物）和Islet1（ISL1基因，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物）的陽性細(xì)胞密度或陽性細(xì)胞百分比均無顯著差異。然而，與對照組相比，成年斑馬魚視網(wǎng)膜在10 μg/L后的陽性細(xì)胞密度和陽性細(xì)胞的百分比顯著降低。用藥組中視網(wǎng)膜色素上皮中的一種蛋白質(zhì)Rpe65（類視黃醇異構(gòu)水解酶65）的百分比顯著高于對照組。

10 μg/L的吡蟲啉暴露顯著改變了4個(gè)視蛋白基因的表達(dá)節(jié)律，即opn1mw3、opn1lw2、opn1sw2和rho、一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因gnb3b和一個(gè)抑制蛋白基因arr3a與視網(wǎng)膜中的光轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。此外，與視黃醇代謝相關(guān)的基因rpe65a的相對表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化。然而，相對表達(dá)水平在24h期間的非視覺視蛋白基因opn3和opn4b，和sox2，胰島1和hcrt沒有顯著改變。

通過靶向代謝組學(xué)分析，研究了成年斑馬魚中吡蟲啉暴露后參與神經(jīng)遞質(zhì)功能的39種代謝物的改變。如圖顯示了吡蟲啉處理組與對照組的39種代謝物含量的熱圖。吡蟲啉暴露后，斑馬魚大腦中16種代謝物水平發(fā)生顯著變化，其中11種代謝物升高。KEGG通路分析顯示，有10條通路顯著富集，其中9條通路參與代謝，1條與遺傳信息處理相關(guān)。前三的代謝途徑是精氨酸生物合成；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝和色氨酸代謝。網(wǎng)絡(luò)分析可以直觀地探索為一個(gè)交互式網(wǎng)絡(luò)，其節(jié)點(diǎn)（代謝物）大小對應(yīng)于節(jié)點(diǎn)度和基于兩個(gè)連接節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性的邊緣厚度。六種富含丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的代謝物和五種富含色氨酸代謝的代謝物主要通過L-谷氨酸相互作用和影響。

一些研究報(bào)告稱，吡蟲啉暴露在高劑量或亞致死劑量下誘發(fā)昆蟲視覺功能障礙。在本研究中，將成年斑馬魚暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的吡蟲啉中21天，結(jié)果表明，吡蟲啉暴露通過破壞視蛋白和光傳導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)基因的表達(dá)節(jié)律，導(dǎo)致斑馬魚的視覺行為異常，導(dǎo)致色氨酸代謝失衡谷氨酸系統(tǒng)與光敏功能和視覺處理有關(guān)。作者的研究證實(shí)了新煙堿類殺蟲劑所造成的視覺毒性風(fēng)險(xiǎn)。此外，研究結(jié)果可能為晝夜節(jié)律和視網(wǎng)膜功能之間的相互作用提供證據(jù)。

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